Título: Abordagens em Microscopia de Fluorescência e Análise de “Phasor” Espectral Aplicadas ao Estudo em Tempo Real da Infecção Viral em Células Vivas
Autor(es): Victor Augusto Roncaglia Pereira, Andressa Santos, Andrea Cheble de Oliveira, Andre Marco de Oliveira Gomes
Resumo: Os processos de interação vírus-células são extremamente dinâmicos. Durante o ciclo celular dos vírus, ele manipula diversos mecanismos naturais das células, explorando os mecanismos celulares para favorecer sua própria replicação. Neste contexto, novos padrões moleculares são produzidos, novas estruturas são formadas e mudanças significativas ocorrem no metabolismo e organização das células hospedeiras. Uma vez que muitas das técnicas tradicionais de estudo da interação vírus-hospedeiro requerem a fixação ou purificação de componentes celulares, estudar esses processos em células vivas ainda é um desafio. Por meio do uso da microscopia óptica em conjunto a sondas sensíveis ao microambiente, como as sondas solvatocrômicas, é possível estudar esses fenômenos a partir de componentes específicos das células (p.e.: RNA viral e membranas lipídicas) com mínimo impacto nas células. Sendo assim, O objetivo desse trabalho é aplicar a análise phasor de imagens espectrais utilizando as sondas Pironina Y - para rastrear dupla-fita de RNA - ou Laurdan - para entender modificações de organização de membranas lipídicas – em células infectadas com vírus da febre Chikungunya (CHIKV). Para isso, células de rim de hamsters recém-nascidos (BHK-21) foram infectadas com uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 com o vírus da febre Chikungunya. O comprimento de onda de excitação foi ajustado para 514 nm (Pironina Y) e 405 (Laurdan) e as imagens foram coletadas usando o detector espectral Quasar do microscópio Zeiss LSM 710 cobrindo comprimentos de onda de 416 a 728 nm. A análise de fasores espectrais foi feita por meio do software simFCS 4. Nossos resultados demonstram a distribuição das dupla-fitas de RNA dentro das células infectadas e significativas diferenças na organização de membranas lipídicas ao longo da infecção viral. Esses resultados reforçam o poder da análise de imagens espectrais no estudo de interações patógeno-hospedeiro em sistemas vivos.